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金钻脚轮电泳技术

发表时间:8:13:41

五种金钻脚轮电泳技术的比较
sdspage
  名词解释：
  相对迁移率（rf）
  问答题:
  1.简述sds-page的基本原理。
  2.影响sds金钻脚轮电泳的关键因素有哪些？  age
 名词解释
1.迁移率
2.电渗
3.金钻脚轮电泳
 问答题
1.影响金钻脚轮电泳迁移率的因素有哪些？
2.试述琼脂糖凝胶金钻脚轮电泳分离脂蛋白的原理。 came
1.came的基本原理是什么？
2.came分离血清蛋白金钻脚轮电泳时应注意哪些问题？ page
名词解释
1.凝胶总浓度
2.交联度
问答题
1.与came相比，page有哪些特点。
2.试比较came与page操作的区别。
3.简述不连续page的原理。 
1.琼脂糖凝胶金钻脚轮电泳agarose gel electrophoresis
 gel electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的金钻脚轮电泳。
 特点（characteristic）：
1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 
2. 金钻脚轮电泳操作方法简便，金钻脚轮电泳速度快。
3. 分辨率高，重复性好，金钻脚轮电泳图谱清晰。
4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。
（一）优点（advantage)
1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。
2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。
3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。
4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。
5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。
6.有热可逆性。
（二）缺点(disadvantage)
1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。
3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，金钻脚轮电泳后必须立即固定染色。
4.与page相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。 
应用
1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化
2. 临床生化检验中常用于ldh、ck等同工酶的分离与检测
3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标
  影响迁移的因素
 
琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白
原理：      血清脂蛋白经饱和苏丹黑b预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在ph8.6巴比妥缓冲液中金钻脚轮电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。
 ph 8.6 > pi ，各种脂蛋白均带负电，金钻脚轮电泳时由负极到正极；vldl为圆形，受阻力小，ldl形态不规则，受阻力大，所以vldl跑在前。
加样槽在负极，由负极到正极分别是cm\ldl\vldl\hdl
2.醋酸纤维薄膜金钻脚轮电泳cellulose acetate membrane electrophoresis，came
特点：低吸附作用，低电渗作用，样本用量少，亲水性
1.low sorption
2.low electroosmosis 
3.small sample
4.hydrophilic 
金钻脚轮电泳图谱不齐
①点样时血清点加不均匀
②薄膜局部干燥
③金钻脚轮电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少
④缓冲液变质
⑤金钻脚轮电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 
金钻脚轮电泳图谱分理不清
①点样时血清点加不均匀
②薄膜局部干燥
③金钻脚轮电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少
④缓冲液变质
⑤金钻脚轮电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 
金钻脚轮电泳速度慢
1. 浓缩效应
1）凝胶层的不连续性
  两层凝胶t与c不同孔径不同
  浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
 2）缓冲液离子成分的不连续性
甘氨酸（pi=6.0）在ph8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（ph6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（m ）很低，移动速度较慢，称为慢离子。
hcl 是强电解质，=1，cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。
蛋白质（pi＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。 
3）ph值的不连续性
     为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间ph值有所区别。
3.分子筛效应与电荷效应
    进入分离胶后，gly-成为快离子
    分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离
page特点
1.具有分子筛效应，分辨率高
2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g
3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团
4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象
5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明
6.网孔可调节  4.sdspage
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,sds,also called lauryl sulfate)
是一种阴离子去污剂(anionic detergent )。
? 作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性
(denature)而改变原有的构象;
? 保证蛋白质分子与sds充分结合而形成带负电荷的蛋白质-sds复合物。
原理

 
 电流过低
 供给薄膜的液量不足
 缓冲液离子强度过高
 薄膜中杂质 
白蛋白区带中间部分不着色，染色不足
染色时间不够、点样过多
γ球蛋白向反方向移动
电渗现象，可提高缓冲液液面或加大电流量以改进
区带一边长一边短呈扭曲现象
薄膜未紧压在金钻脚轮电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。 
区带拖尾或区带过于紧密
缓冲液离子强度＜0.05可出现区带拖尾；离子强度＞0.075可出现区带过于紧密。
血清蛋白质醋酸纤维薄膜金钻脚轮电泳separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis
[原理] came是以醋纤膜（cam）作支持物的一种区带金钻脚轮电泳技术。
      将血清样品点样于醋纤膜上，在ph8.6的缓冲液中金钻脚轮电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而金钻脚轮电泳迁移率不同，彼此得以分离。加样：用加样器蘸取血清约5ul，垂直印在cam粗糙面，点样区距离边缘约1.5cm，金钻脚轮电泳时点样面朝下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10~15v/cm膜总宽。金钻脚轮电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。
由负极到正极可分为五条条带
γ β α2 α1 白蛋白
3.聚丙烯酰胺凝胶金钻脚轮电泳polyacrylamide gel electrophoresis page
        pag是由丙烯酰胺（acrylamide，acr）单体和n，n＇-亚甲双丙烯酰胺（n，n，n＇，n＇-methylene bisacrylamide，bis）交联剂通过自由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。
    过硫酸胺[(nh4)2s2o8]（ammonium persulfate，ap）作为催化剂，四甲基乙二胺（-n,n,n＇,n＇-tetramethylethylene diamine , temed）为加速剂。 
?temed量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合
  -分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧
  ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
pag孔径的大小主要由acr和bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。
acr/bis：20~40   完全透明且有弹性；
         ＜10    很脆，易碎，不透明；
         ＞100   糊状不成形，易破碎
常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶
交联度c——bis占单体与交联剂总量的百分比。
c=b/（a b）×100%
电极槽缓冲液通常为ph8.3 tris-甘氨酸缓冲液 
分离原理
（一）蛋白质分子的解聚
    样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的金钻脚轮电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而电荷因素可以被忽略。
1、sds
   阴离子去污剂(anionic detergent )
   变性剂(denaturant)
   助溶性试剂 
    断裂分子内和分子间的氢键(hydrogen bond)
    分子去折叠
    破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2、强还原剂
   巯基乙醇（β-mercaptoethanal）
   
   二硫苏糖醇（dithiothreitol，dtt） 
   使半胱氨酸残基之间的二硫键(disulfide bond)断裂。
 sds和还原剂的作用：
（1）分子被解聚
（2）氨基酸侧链与sds充分结合形成带负  
     电荷的蛋白质-sds胶束。
（3）蛋白质-sds胶束所带的负电荷大大超   
     过了蛋白质分子原有的电荷量，消除
     了不同分子之间原有的电荷差异。
去污剂的选择
无离子去污剂：lubro w；brij35， tween    
              triton
阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium 
              bromide （ctab）
              cetylpyyridinium （cpc）
阴离子去污剂：sds   deoxycholate
金钻脚轮电泳过程中的不正常现象
（1）“微笑”现象
    指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。
2）“皱眉”现象
    由于垂直金钻脚轮电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。
（3）“拖尾”现象
     样品溶解不佳引起。
（4）“纹理”现象
由于样品中的不溶颗粒引起的。
（5）偏斜现象
    电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起
（6）带太宽
     加样量太多或加样孔泄漏引起
分子量测定
1、相对迁移率（relative mobility ，rf）
  rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。
  测量位置应在蛋白带的中央。 
      蛋白带迁移距离
rf=  ————————
      溴酚蓝迁移距离
蛋白带迁移距离      固定前的凝胶长度
   rf= ————————— x  —————————    
     干燥后的凝胶长度      溴酚蓝迁移距离
2、作图
   以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的rf值，便可在标   
   准曲线上读出他的分子量
5.等电聚焦金钻脚轮电泳isoelectric focusing electrophoresis， iefe 
等电聚焦金钻脚轮电泳(iefe)是一种利用具有ph梯度的支持介质分离等点电(pi)不同的蛋白质的金钻脚轮电泳技术。
原理：    在金钻脚轮电泳介质中加入载体两性电解质，通电后，两性电解质会逐渐形成一个由正极到负极递增的ph梯度，在此体系中，不同的蛋白质移动并聚焦于与其等电点相当的ph位置。
理想的载体两性电解质应具备的特征
①化学性质稳定；
②分子量要小
→以便与被分离大分子物质分离；
③各成分的pi彼此接近，并在其pi值附近有良好的缓冲能力
→梯度稳定；
④两性电解质载体的数目要足够多
→梯度平滑 ；
⑤对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度
→不影响测定。
优点： 
 分辨率高（可达0.01ph单位）；
 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）；
 金钻脚轮电泳区带狭窄；
 重复性好。
缺点： 
 要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀； 
 由于样品中的成分会停留在其pi，不适用在pi不溶的蛋白质。
iefe应用 
 1.分析分离制备蛋白质、多肽 
 ①区分人血清蛋白 
 ②测出异常免疫球蛋白 
 ③基因分型 
 ④csf中寡克隆区带的检测 
 2.测定pi可鉴定蛋白质、多肽 
 3.双相金钻脚轮电泳中，iefe作为第一相