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金钻脚轮表面处理-电泳技术

发表时间:16:05:59

电泳技术概述
　　电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的ph值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。# p# w8 ^# {: r% m＇ g
　   电泳过程必须在一种支持介质中进行。tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如hplc等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
　    电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm  14 cm，厚度为1mm～2? mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于ph值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
　   为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（v），就会在电极中间产生电场强度（e），l是电极间距离。4 _$ p7 ^5 i5 h2 r/ f
　   在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（f），等于所带净电荷与电场强度的乘积。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（f’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，f’的大小服从stokes定律，即：f’=6πrηυ式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： f = f’，q?e = 6πrηυ由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
       用sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，实际使用的是相对迁移率mr。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
凝胶电泳的实验原理
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　　聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离dna片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的dna片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段dna(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的dna片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的dna,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行dna电泳。
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琼脂糖凝胶电泳原理：
       琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由d－半乳糖和3,6脱水l－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在dna制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。
　    琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于dna、rna分子的分离、分析，由于dna、rna分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链dna，电泳迁移率的大小主要与dna分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 c时熔化，因此其中的样品如dna可以重新溶解到溶液中而回收。
       由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及dna、rna的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：
1） 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。* l9 z3 w" v0 ]6 ^, d
2） 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
3） 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
4） 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：0 |( f# p# ?2 g6 v* x9 x- n
       聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为page（polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（ch2=chconh2 acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（ch2(nhcohc=ch2) 2 n,n’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（ap）以及加速剂四甲基乙二胺（temed），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的ph对聚合作用是重要的，因为过低ph没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使acr发生聚合作用。
 
　   聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离dna；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。选择t和c的经验公式是：c = 6.5－0.3t此式可用于计算t为5％～20％时的凝胶组成。c值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 1％，当c保持恒定时，凝胶的有效孔径随着t的增加而减小，当t保持恒定，c为4％时，有效孔径最小，c大于或小于4％时，有效孔径均变大，c大于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的c是2.6％和3％。6 ]" p/ ^/ w: h e＇ a
　   由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有：
1、 可以随意控制胶浓度“t”和交联度“c”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。( x% x2 y5 y; u% c1 m
2、 能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10－9 ～10－12 mol/l。! e% \# b9 f7 p3 p! m( r＇ x
3、 由于聚丙烯酰胺凝胶是由－c－c－键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基－co－nh2 ，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”。% t: w f m z$ a2 ]) _
4、 由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。
5、 透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。
6、 无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。$ h3 a% m# f& ?1 [: m/ ^
7、 还可以用作固定化酶的惰性载体。
核酸电泳指示剂的选择
指示剂：- g# v5 u# ?& q9 ]1 d) o  ^5 b
       核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1kb、 0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性dna片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2kb和1.6kb的双链线性dna大致相似。3 [& m) v0 m- o s
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有：
1、 增加样 品密度，使其比重增加，以确保dna均匀沉入加样孔内。) i6 h" ]2 t8 \7 @＇ [/ l
2、 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置。
3、 使样品呈色，使加样操作更方便。
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染色剂：! v" q/ [6 l( u6 e( t% i* w
   核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。( s( u) ~$ {. w( b
   溴化乙锭(ethidium bromide，eb)是一种荧光染料，eb分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的eb，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶eb染色，肉眼可见核酸电泳带，其dna量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。
　　银染色液中的银离子(ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比eb高200倍.但银染色后，dna不宜回收。
琼脂糖凝胶电泳
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主要试剂：
　　核酸电泳缓冲液有三种，即tris-硼酸(tbe)、tris-乙酸(tae)和tris-磷酸(tpe).tbe与tpe缓冲容量高，dna分离效果好，但tpe在dna片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使dna沉淀.tae缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用tbe.缓冲液中的edta可螯合二价阳离子，从而抑制dna酶的活性，防止pcr扩增产物降解。; y! p) z/ v7 ~3 d1 n; q
核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有：8 f5 {% p7 |! _ a
1) tbe：0.08mol/l tris•hcl，ph8.5，0.08mol/l硼酸，0.0024mol/l edta
2) the：0.04mol/l tris•hcl。ph7.8，0.2mol/l醋酸钠，0.0018mol/l edta
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主要实验步骤：" |, j( h& a( e＇ u! ~( j. ?
1、 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子。# h& n＇ |＇ a＇ v0 u% i j. i
2、 取5×tbe缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×tbe稀释缓冲液,待用。 ! u; ~  h# x# m7 h1 g
3、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×tbe稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
4、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(eb溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把eb加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的eb溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×tbe稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。1 x6 i% d0 k9 h: r3 a9 x
   琼脂糖浓度的配置可参照下表：8 k  i$ i6 m z& s7 ]; g; n
琼脂糖浓度(%) 线型dna分子的分离范围(kb)
0.3 5～60
0.6 1～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.9～6
1.5 0.2～3
12.0 0.1～2
5、 样品制备与加样：溶解于tbe或the内的样品应含指示染料（0.025％溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％），也可使用2.5％fico ⅱ增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10μg。
6、 电泳：一般电压为5-15v/cm。对大分子的分离可用电压5v/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。
7、 样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的dna分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100v电泳2-3小时，然后正负电极交换，反向电泳2分钟，使透析袋上的dna释放出来。吸出含dna的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。
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注意事项：5 o- x* ?: y" d& p
1、 加热时, 一定要煮沸, 以保证琼脂糖的完全溶解。6 @" z5 y, @/ t3 c/ b
2、 ?待溶液冷却至不烫手, 感觉温暖舒适时加eb. 一定要在通风柜里。
3、 倒胶时, 可用干净的纸巾拭去气泡。
4、 胶凝固后先倒入些电泳缓冲液以方便取梳子。4 h＇ e5 d4 c2 i＇ v! g0 ?4 s: w
5、 保证缓冲液淹过胶的边沿, 边沿部分常高出1-2mm。
6、 有时需要大的上样孔, 可用胶带把几个相邻的梳齿粘在一起, 这种情况下, 尽量让胶液冷一些再倒胶。
7、 ?如果只是为了看一下结果(不需要照相), 同一块胶可重复用1-3次. 有一次我跑了4遍, 条带很弱, 用加了eb的缓冲液(约10ul eb in 50ml 缓冲液)泡半小时后就如正常了。
8、 要保存胶到第二天用, 可以保鲜膜包裹后放入4 度冰箱。: x, ~% @7 [) w$ j＇ r% e! [$ h$ ]6 u
9、 tae 电泳缓冲液也可重复使用, 至少10次没有问题。
10、 为了防止电泳时两极缓冲液槽内ph和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。